Laboratoire Matière et Systèmes Complexes

Thèse de Alice Grangier effectuée sous la direction de Amanda Silva Brun, Claire Wilhelm et Florence Gazeau.

Soutenance le 17 juin 2022 à 14h00 en salle des Conférences (R229) du Campus Saint-Germain-des-Prés de l’Université Paris Cité (45 rue des Saints-Pères, 75006 Paris).

Stimulation par un flux turbulent en bioréacteurs pour la production de vésicules extracellulaires

Résumé : Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des particules nanométriques sécrétées par toutes les cellules de l’organisme dont le contenu, dépendant de la nature et de l’état de la cellule qui les a émises, leur confère de nombreuses propriétés thérapeutiques. Cependant, les faibles rendements de production de ces vecteurs biologiques restent un verrou majeur à leur translation clinique. Dans ce contexte, notre laboratoire a développé une technique de production à haut rendement, adaptable à grande échelle selon les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF), consistant à induire un flux turbulent en bioréacteurs pour stimuler des cellules sur des micro-porteurs. Le but principal de cette thèse a été d’étudier l’effet de la turbulence en bioréacteurs sur les cellules productrices et sur leur "sécrétome", incluant des VEs.

Tout d’abord, nous avons montré que la turbulence était bien tolérée par des cellules adhérentes, puis évalué de façon semi-quantitative les biomarqueurs des VEs produites par turbulence.

Un autre objectif majeur a été d’étendre le cadre de la production à haut rendement de VEs par turbulence à des cellules en suspension. Nous avons montré que suite à une stimulation par turbulence, trois différentes lignées cellulaires permettaient d’obtenir des quantités massives de particules comparées à la carence en sérum. De plus, nous avons mis en évidence qu’un compromis entre la viabilité et le rendement de particules pouvait être atteint en modifiant également le temps d’exposition à la turbulence. Ces résultats ont d’abord été obtenus dans des récipients de 100 mL puis à plus grande échelle en récipients de 1 L. Ensuite, nous avons étudié l’effet de la viabilité cellulaire sur l’identité et la fonctionnalité du sécrétome issu de cellules THP-1, révélant une modulation des caractéristiques physiques et biologiques due à la turbulence. En outre, l’analyse du sécrétome des THP-1 par le fractionnement par couplage flux-force à l’aide d’un flux croisé nous a permis d’observer une sous-population, composée de petites particules et spécifique à la turbulence, dont la nature et la fonctionnalité devront être caractérisées dans des études ultérieures. Finalement, nous avons proposé une analyse rétrospective des données multimodales acquises au cours de ces travaux, confirmant une identité biologique et fonctionnelle du sécrétome enrichi en VEs dérivé de THP-1.

Abstract : Extracellular vesicles (EVs) are nanometric particles secreted by all cells, whose content may depend on the nature and state of their parent cells, leading to multiple therapeutic applications. However, large scale manufacturing of extracellular vesicles (EVs) remains a challenge hindering the successful translation of EV-based therapies into clinics. In this context, our laboratory developed a high-yield and scalable production method for EVs compatible with Good Manufacturing Practice (GMP) by inducing a turbulent flow in bioreactors to stimulate cells attached to microcarriers. The main aim of this thesis was to study the effect of turbulence in bioreactors on producer cells and their "secretome", which includes EVs.

First, we showed that turbulence was well tolerated by adherent cells and semi-quantitatively assessed biomarkers of turbulence EVs.

Another major objective was then to extend the framework of turbulence high-yield EV production to cells in suspension. We showed that upon turbulence stimulation, three different cell lines yielded massive amounts of particles compared to serum starvation. Moreover, we evidenced that a trade-off between viability and particle yield could be achieved by also modulating turbulence stimulation duration. This was achieved first in 100 mL vessels then up scaled to 1 L vessels. Next, we investigated the effect of cell viability on the identity and potency of THP-1 derived turbulence secretome, revealing a modulation of physical and biological characteristics. Then, the analysis of THP-1 secretome by asymmetric flow field-flow fractionation enabled us to shed light on a turbulence specific subpopulation of small particles. Further investigation will be required to evaluate the nature and potency of this subpopulation. Finally, we proposed a retrospective analysis of the multimodal data acquired during this study which also confirmed a specific phenotypic and functional identity of THP-1 derived turbulence EV-enriched secretome.