Elasticité membranaire


La membrane du globule rouge humain

Le globule rouge humain a le grand avantage d'être la plus simple des cellules : il a perdu noyau, organelles et cytosquelette au cours de sa maturation, et il s'agit simplement d'un sac, contenant une solution d'hémoglobine, et fermé par une membrane. Celle-ci est, comme toutes les membranes, une bicouche lipidique contenant de nombreuses protéines membranaires (dont les canaux ioniques, indispensables aux échanges gazeux). Cette bicouche présente une résistance énorme à la dilatation. Par contre elle est liquide et ne résiste donc pas au cisaillement que subit le globule rouge au cours de son voyage périodique dans la circulation sanguine. C'est un squelette couplé à la bicouche lipidique qui apporte cette résistance au cisaillement. Il s'agit d'un réseau triangulaire d'une protéine fibreuse, la spectrine, attaché à la membrane du côté cytoplasmique en des points particuliers (les nœuds du réseau, dits complexes de jonction, et un point intermédiaire le long de la spectrine). 


Membrane du globule rouge humain.
Elle est composée d'une bicouche lipique
sous laquelle est ancré un réseau protéique,
le squelette.
Delaunay et Boivin, La Recherche 1990

Nous avons dans un premier temps mesuré les propriétés élastiques de la membrane du globule rouge humain. Il s'agissait donc de lui appliquer une contrainte connue et de mesurer la déformation induite pour en déduire le module élastique. Cette contrainte était appliquée par pinces optiques, via des billes de silice collées de manière non spécifique à la membrane du globule rouge. La gamme des forces appliquables va seulement jusqu'à la centaine de pN. C'est insuffisant pour obtenir une extension de la membrane. Par contre ces forces permettent de cisailler la membrane, et nous avons ainsi pu mesurer son module de cisaillement. Nous avons sélectionné des globules rouges avec deux billes collées en périphérie en positions diamétralement opposées (cf. figure ci-dessous). Des forces opposées sont appliquées à ces billes par pinces optiques, et la diminution du diamètre est mesurée en fonction de la force appliquée.

Globule rouge humain
en microscopie optique en transmission.

Deux billes de silice sont collées sur sa membrane
en positions diamétralement opposées.
Il se déforme sous l'effet de l'application sur les billes, par pinces optiques, de deux forces opposées.

Cette mesure permet de déterminer la valeur du module élastique de cisaillement.

Haut :
Variations de diamètre d'un globule rouge humain
en fonction de la force appliquée


Bas :
Distribution de la valeur du module de cisaillement
de la membrane du globule rouge humain,
mesuré par pinces optiques, à 25°C,
sur 30 globules rouges humains discoïdes
et 6 globules rouges humains sphériques

Nous avons obtenu pour la valeur du module de cisaillement du globule rouge humain à 25°C : 2.5 ± 0.4 µN/m. C'est du même ordre de grandeur, mais plus petit, que les valeurs obtenues par différents groupes par la méthode des micropipettes : entre 4 et 10 µN/m. Nous avons expliqué cette différence par le fait que notre mesure se fait effectivement dans la limite des petites déformations, contrairement aux mesures par micropipettes.


Le squelette de la membrane du globule rouge humain

(thèse de Guillaume Lenormand)

Le squelette de la membrane du globule rouge humain présente l'intéressante particularité de pouvoir être aisément extrait. Il suffit d'un lavage au détergent pour se débarrasser de la bicouche lipidique et ne conserver que le squelette. Cette particularité nous a permis de manipuler par pinces optiques le squelette isolé du GRH, en utilisant la procédure décrite sur la figure ci-dessous. 

Une suspension de globules rouges humains
et de billes de silice dans une solution tamponnée
est injectée sous l'objectif du microscope.


On sélectionne un globule rouge
avec 3 billes collées à sa périphérie
et on le maintient sous légère tension par trois pièges optiques.


La bicouche est lavée par une solution détergente
(Triton X100), puis on rince avec une solution tampon
ayant la force ionique désirée.


Le squelette est déformé par application de 3 forces,
de directions et modules variables.
On mesure la déformation en fonction des forces appliquées.

Une fois le squelette extrait, différents types de contraintes lui sont appliqués par pinces optiques : des contraintes proches d'un cisaillement pur, proches d'une extension pure, ou mélanges d'extension et de cisaillement. La contrainte est connue, à environ 10% près, par la connaissance des forces appliquées. La déformation est calculée par la position des billes, en supposant la déformation du squelette uniforme. Des courbes typiques de contrainte et déformation sont données sur la figure ci-dessous. La pente de ces courbes donne la valeur du module élastique d'extension ou de cisaillement.

      
Mesures mécaniques par pinces optiques sur le squelette d'un globule rouge humain :
contrainte en fonction de la déformation pour une extension pure (A) et un cisaillement pur (B).
La pente donne le module d'extension KC ou de cisaillement µC.

Les valeurs de module de cisaillement mesurées sur les squelettes isolés sont du même ordre de grandeur que celui de la membrane entière du globule rouge humain. C'est ce à quoi on s'attend puisque c'est le squelette qui donne à la membrane sa résistance au cisaillement. La figure ci-dessous donne l'ensemble des mesures réalisées sur des squelettes dans un tampon à basse force ionique (5 mM NaCl, 5 mM K2HPO4, pH=7.4, 25 mOsm/kg).

     

Modules élastiques d'extension (A) et de cisaillement (B) 
mesurés sur des squelettes de GRH en milieu hypotonique (25 mOsm/kg)

Les distributions présentent clairement 2 pics, ce qui se comprend aisément si on se rappelle que le squelette est un filet fermé, et qu'on tire donc sur un ou deux feuillets suivant le cas. On mesure donc soit KC (resp. µC) soit 2KC (resp. 2µC). Ces distributions ont été ajustées par des doubles gaussiennes, dont le deuxième centre est le double du premier. En outre, les mesures montrent que KCC vaut 2 en moyenne, comme on s'y attend pour un réseau triangulaire de ressorts de raideur k : on attend KC = 2µC = 31/2k/2. On peut alors déduire des mesures la valeur de k. Ce ressort n'est autre qu'un filament de spectrine. Son élasticité, d'origine entropique, peut être décrite par le "modèle du ver", elle est inversement proportionnelle à sa longueur de persistance. Nos mesures nous ont donc permis de mesurer la longueur de persistance d'un filament de spectrine. Les mesures ont été répétées à différentes forces ioniques. La figure ci-dessous donne les variations de KC et de µC en fonction de l'osmolarité, et de la longueur de persistence en fonction de la force ionique FI. La longueur de persistance a été ajustée par une loi de type "OSF" (Odijk, Skolnick et Fixman).

       

La régression donne une longueur de persistance stérique égale à 2.3 nm, cohérente avec des estimations précédentes, et une distance entre charges égale à la distance de Bjerrum, 0.72 nm, ce qui est en parfait accord avec un modèle de condensation de Manning des ions. Les résultats sont donc étonnamment satisfaisants, compte-tenue de la piètre précision des mesures.

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