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Invasion par les microalgues

Thibault Camille
Gaubert Léna
Bouchaud Paul
S6 2020
____________________________________________________________________________________

Tables de Matières:

  1. Introduction
  2. Chlamydomonas reinhardtii
  3. Aspects théoriques
  4. Anticipation des résultats expérimentaux
    1. Déplacement d'une particule
    2. Phénomènes de groupe
    3. Chémotaxie
    4. Bateau
  5. Problématiques expérimentales
  6. Conclusion
  7. Partie expérimentale
    1. Premier problème: tracking des algues
      1. Code
      2. Expérience
      3. Résultats et discussions
    2. Second problème: diffusion active
      1. Code
      2. Expérience
      3. Résultats et analyses
  8. Conclusion
  9. Remerciements
  10. Sources

I-Introduction:

Souris blanche de la biologie végétale, la Chlamydomonas reinhardtii (C.R.) est une microalgue unicellulaire photosynthétique utilisant deux flagelles pour se mouvoir. Photosensibles, les flagelles effectuent un mouvement de brasse, et en se détachant d'une interprétation anthropocentrique, nous étudierons leurs mouvements à l’échelle individuelle avant de considérer des mouvements collectifs. Comment ces algues occupent progressivement l'espace qu'on leur donne à disposition ?

Figure 1: a.(droite) Dartmouth College Electron Microscope Facility Chlamydomonas reinhardtii au microscope électronique en fausse couleur
b.(gauche) Ikenokochi Marsh (grossissement {$\times 640$})

II-Chlamydomonas reinhardtii

Les Chlamydomonas reinhardtii (C.R.) sont des organismes unicellualaires, classifiés comme algues vertes, présents dans les sols, dans l'eau douce et même dans la neige. Elles effectuent grâce à leurs deux flagelles antérieurs (~12 μm) des mouvements de brasse à une fréquence de battements pouvant aller jusqu'à 60 Hz dépendant de la souche considérée. Lorsqu'elles sont en pré-culture, les Chlamydomonas reinhardtii n'ont quasiment pas de nutriments à leur disposition, ce qui entraîne chacun des cellules à adopter la même taille réduite. Une fois leur taille fixée, on prélève une fraction de ces micro-algues pour les placer dans un milieu frais riche en nutriments (TAP ou HSA dépendant des souches utilisées), avant de les mettre en culture dans des incubateurs où elles suivent des rythmes jour/nuit. Tout comme beaucoup de variables biologiques, la répartition du diamètre des Chlamydomonas reinhardtii suit une distribution normale, ( cf. Résultats expérimentaux). Les variations autour de ce diamètre s'expliquent notamment par l'âge des cellules (reproduction la nuit). Parmi leurs nombreuses caractéristiques, on retient notamment leur sensibilité à la lumière: en effet, grâce à leur œil rudimentaire aussi appelé "stigma", situé sous l'un des flagelles, elles captent la lumière et nagent en direction de la source lumineuse. Cependant, une illumination trop importante engendre une réponse inverse des Chlamydomonas: celles-ci fuient alors la lumière. Bien qu'elles soient photosynthétiques, elles sont pas sensibles à toutes les longueurs d'onde: les Chlamydomonas sont peu réceptives aux lumières dont la longueur d'onde est supérieure à la longueur d'onde de la lumière rouge. Ainsi, on fait appel à un filtre rouge au cours de nos observations au microscope, afin de pouvoir mener à bien nos expériences. A noter que leur fréquence de battements: plongées dans l'obscurité, on mesure une fréquence plus basse que lorsque éclairées. Certaines espèces mutantes créées en laboratoire ont un comportement inverse: elles fuient la lumière qu'importe l'intensité lumineuse. Les acquisitions et analyses effectuées au cours de ce projet furent réalisées avec des CC-124 cultivées en incubateur au laboratoire MSC (Condorcet), approvisionné par le Chlamycenter (USA). Plus souvent utilisées en laboratoire, elles sont attirées par la lumière, ce qui a facilité nos observations et expériences.

Nous avons également manipulé des micro-algues des souches CC-124 et T222 de l'IBPC. Il s'agit de mutations des Chlamydomonas reinhardtii, processus très courant en laboratoire. La souche CC-124 est une souche "sauvage basique", il s'agit avec la souche CC-125 de la souche la plus couramment utilisée en laboratoire: elle possède deux mutations, nit1 et nit2, qui l'empêche de pousser sur du nitrate comme unique source d'azote. Tandis que celles du Chlamycenter sont attirées par la lumière, celles de l'IBPC la fuit (cf. observations expérimentales). La souche T222 est quand à elle une autre mutation, qui diffère notamment des CC-124 de par leur croissance plus lente.

Mise à part leur photosensibilité, on remarque également leur comportement photosynthétique: grâce à leur stigma, elles captent l'énergie lumineuse et effectuent la photosynthèse à l'aide du chloroplaste dont elles sont pourvues. Certaines études ont montrés l'existence de comportements chimiotactique lorsqu'on introduit des substances nutritives dans leur milieu, mais aussi gravitactique (les C.R. nagent contre la gravité). Leurs diverses propriétés font d'elles -et ce depuis les années 50- un excellent modèle pour étudier des questions fondamentales de la biologie.

III-Aspects théoriques

Équation de diffusion

Considérons une particule ponctuelle dont le mouvement est régi par une marche brownienne passive i.e. la particule se meut aléatoirement selon un axe (Ox) discrétisé tel que {$x_{m}$}={$m\Delta$} ({$~où~m\in Z$}) au cours du temps, également discrétisé avec {$t_{n}=n\tau$}. On définit {$C_{n}(m)~$} la probabilité de trouver la particule à la position {$x_{m}$} au temps {$n\tau$}. Positionnée en {$m\Delta$} au temps {$n\tau$}, la particule peut se déplacer vers la gauche ({$(m-1)\Delta$}) ou vers la droite ({$(m-1)\Delta$}) de manière équiprobable, soit: {$$C_{n+1}(m)=\frac{C_{n}(m+1)+C_{n}(m-1)}{2}$$}

Supposer une variation spatiale et temporelle lente de {$C_{n}(m)$} justifie les développements en série de Taylor suivants:

{$$C_{n+1}(m) \simeq C_{n}(m) + \tau \frac{\partial C_{n}(m)}{\partial t}+ o(\tau^2)$$} {$$C_{n}(m \pm 1) \simeq C_{n}(m) \pm \Delta \frac{\partial C_{n}(m)}{\partial x}+ \frac{\Delta^{2}}{2} \frac{\partial^{2} C_{n}(m)}{\partial x^{2}} + o(\Delta^3) $$}

Développements grâce auxquels on obtient finalement :

{$$ \frac{\partial C_{n}(m)}{\partial t} = D_T \frac{\partial^{2} C_{n}(m)}{\partial x^{2}} \qquad avec \qquad D_T= \frac{\Delta^{2}}{2\tau} [en~unité~de~surface~par~unité~de~temps]$$} On interprète {$\Delta$} comme étant la longueur typique que parcoure l’algue avant de changer brutalement de direction et {$\tau$} la durée durant laquelle l’algue parcoure cette distance. On qualifie ce mouvement de "run and tumble". Pour un mouvement brownien passif le coefficient de diffusion translationnelle vaut {$D_T=\frac{k_BT}{6\pi\eta R}$}. Les particules subissent également une diffusion rotationnelle avec un coefficient {$D_R=\tau_{R}^{-1}=\frac{k_BT}{8\pi\eta R^3}$} où {$\tau_R$} s'interprète comme la durée typique entre chaque changement de d'orientation, soit après une distance de {$L=v\tau_R$}. De ce qui précède, la position moyenne d'une particule subissant la diffusion passive est confondue avec sa position initiale i.e. {$\langle x(t) \rangle=x_0$}.
Considérons d'autre part une particule soumise à la diffusion active, ce qui correspond à une description plus fidèle du comportement des micro-algues, ces dernières se propulsant grâce à leurs flagelles. La position de la particule est, en moyenne, {$\langle x(t)-x_0 \rangle=\frac{v}{D_R}[1-exp(-D_Rt)]=v\tau_r(1-exp(\frac{t}{\tau_r}))$}.

MSD

Le mouvement individuel des algues semble erratique et ce faisant, il devient impossible de décrire la trajectoire d’une particule unique grâce à la loi de la diffusion. On définit alors le MSD « Mean Squared Displacement », mesure de la déviation moyenne de la position des particules par rapport à leurs positions initiales.
Mathématiquement, il est ainsi défini de la manière suivante: {$ MSD(t) = \langle \mid x(t) - x_{0} \mid ^{2} \rangle $}. Dans le cadre d'une diffusion dite passive, le MSD suit une évolution temporelle affine. Lorsque l'on a {$ MSD \propto t^{\alpha}$} avec {$ \alpha \neq 1 $}, on dit que la diffusion est anormale (pour un mouvement balistique par exemple, {$ \alpha = 2 $}). Pour une particule active l'expression théorique du MSD, tel que défini par Ornstein–Uhlenbeck est {$MSD(t)=[4D_T+2v^2\tau_R]t+2v^2\tau_{R}^2[e^{-\frac{\tau}{\tau_R}}-1]~(\star)$} (Howse et al 2007). On note que {$MSD(t) \propto t$} pour {$t\ll\tau_R$} et pour {$t\gg\tau_R$} et {$MSD(t) \propto t^2$} pour {$t\approx\tau_R$}. En mobilisant ce corpus nous étudierons le mouvement des C.R..

IV-Anticipation des résultats expérimentaux

a- Déplacement d'une particule

Dans un premier temps, nous observerons les microalgues à l'échelle microscopique afin de qualifier et quantifier leur mouvement ("run and tumble"). Ces observations qualitatives, couplées avec des traitements d'images (ImageJ) nous permettrons de déterminer certaines grandeurs microscopiques telles que {$\Delta,\tau$}, le ratio entre mouvement synchrone et asynchrone des mouvements de brasses des flagelles (comparaison avec le corpus) ainsi que de percevoir le comportement des C.R. quand elles sont confrontées à la lumière. Cette photosensibilité sera largement exploitée pour initier la position des particules avant leur diffusion.

Nous avons modélisé numériquement le mouvement des algues afin de pronostiquer nos futurs observations. Une C.R. se déplace selon le principe du "run and tumble": grâce à ses flagelles elle est propulsée en ligne droite ("run") dans une certaine direction avant de vaciller, changer aléatoirement de direction ("tumble") et d'être à nouveau propulsée en ligne droite. Ce type de mouvement mène à une marche aléatoire où les "runs" sont les pas et les "tumbles" les changements de direction aléatoires.
La modélisation débouche sur des comportements conformes à la théorie. En effet pour une diffusion passive, l'évolution temporelle du MSD est affine. Quant à la diffusion active, une évolution balistique suivie d'une évolution affine est observée. A été adjoint aux trajectoires un cercle (rouge) dont le rayon est la racine carré du MSD, permettant une interprétation intuitive de cette grandeur.

a. Diffusion passive de 250 algues (100 pas de temps), b. MSD de 1000 algues en fonction du temps (diffusion passive)

c. Diffusion active de 250 algues (100 pas de temps), d. MSD de 1000 algues en fonction du temps (diffusion active)

e. Ajustement linéaire du MSD en diffusion active

Figure 2: Anticipation des résultats expérimentaux (graphes)

Ci-joints figurent les scripts Python ayant généré les figures ci-dessus : Diffusion active & Diffusion passive & Fit MSD théorique

b-Phénomènes de groupe

Considérons les microalgues en tant que population et étudions la diffusion active de ces organismes. En pratique, les microalgues seront disposées dans une cuvette, dont la taille influera sur l'échelle d'observation et la manière dont on l'éclairera (laser ou lampe). Le corpus nous indiquant que les microalgues fuient la lumière, nous influerons sur la position et l'orientation de la source lumineuse afin d'initialiser la position des microalgues. L'image, en niveaux de gris, acquise, une détection de particules nous permettra de déterminer la distribution des particules, en effectuant cette analyse à plusieurs instants nous en déduirons le coefficient de diffusion. Le coefficient ainsi obtenu sera comparé à celui déduit des mesures à l’échelle "individuelle" (cf section précédente)


Figure 3: Diffusion des particules observé à grande échelle après initialisation des particules au centre (x=1.5(ua))

Figure 4: Image source - distribution gaussienne (bruitée) des particules

Figure 5: Histogramme issu de la détection des particules de l'image source - ImageJ

c-Chemotaxie

Le comportement des microalgues pouvant également être influencé par la présence de substances chimiques dans leur milieu de culture, on pourra s'intéresser, à titre d'exploration, à la chemotaxie. Les C.R. appréciant les sucres, il serait intéressant d'en placer dans leur cuvette et d'observer leur réaction. On déterminera le gradient de sucre et on le comparera au gradient des microalgues (toujours déterminé par traitement d'image). On pourra réaliser la même manipulation avec une substance repoussante. Contrairement à d'autres micro-organismes tels que les Escherichia coli, peu d'études sur la chemotaxie des C.R. ont été, à ce jour, réalisées. Cependant, certains travaux ont relevé le comportement chemoattractant de substances telles que le bicarbonate de soude (source importante de carbone pour la photosynthèse), l'ammonium, ou le chlorure de cobalt. A priori si la substance introduite dans le milieu de culture attire les microalgues, ces dernières auront tendance à suivre une trajectoire linéaire vers la substance tandis que si la substance les repoussent, elles effectueront des "tumbles" et suivront une nouvelle direction aléatoire.

d-Bateau

Nous explorerons la pression exercée par les microalgues sur des "bateaux" i.e. microparticule en suspension dans le milieu de culture. Néanmoins, le corpus nous renseigne sur la présence de cils cellulaires (cilia), sur les C.R., ces cils leur permettent de "sentir" leur environnement. Comme l'illustre la figure 6, lorsqu'une microalgue se retrouve face à une paroi, ces cils l'effleurent et la détectent, l'algue change de direction. L'usage de la chemotaxie et/ou phototaxie permettra, de contrer cette répulsion.


Figure 6: Microalgue évitant une paroi à l'aide de ses cils cellulaires, Source : Kantsler et al. (2013)

V. Problématiques expérimentales:

Répétabilité des expériences
La première partie de notre projet consiste en l’étude du mouvement individuel des algues. Pour ce faire, il nous faut établir le MSD des algues, et donc réaliser un grand nombre de mesures de leur position. Expérimentalement, cela risque de poser un certain nombre de problèmes; le premier étant naturellement celui du temps que nous pouvons nous permettre d’accorder à cette série d’expériences.
La simulation numérique nous indique d'une cinquantaine de traque permet d'obtenir un profil de la déviation moyenne des molécules au cours du temps conforme, en fonction des difficultés opératoire rencontrée nous tenterons d'augmenter ce nombre de traque.

Lumière
Il nous faudra observer les algues grâce à un microscope puissant puisque la dimension des Chlamydomonas reinhardtii est de l’ordre de {$ 10 \mu m$}. L'usage du microscope Nikon Eclipse TS 100 nous permettra d’obtenir des images dont les dimensions sont pertinentes pour les observations que nous souhaitons faire, c’est à dire suffisamment petites pour que l’on puisse distinguer les algues mais suffisamment grandes pour que l’on puisse suivre leur position au cours du temps.
Il faudra néanmoins se placer dans des conditions idéales pour observer les algues: la luminosité devra être controlée et on se propose d’éclairer la cuvette par une lumière rouge (filtre coloré), les C.R. y étant insensibles. Étant donné qu’il sera délicat de suivre le mouvement des particules du fait de leur taille, il le sera encore plus si nous faisons nos observations à une très faible exposition lumineuse. Nous prévoyons de pointer les algues grâce au logiciel ImageJ (Fiji-TrackMate) pour repérer facilement leur position au cours du temps et par conséquent, il faudra que le logiciel soit capable de distinguer, d’une part les algues les unes des autres, et d’autre part les algues de leur milieu de culture. Pour ce faire, nous exploiterons la strioscopie, à l'aide de cache filtrant la lumière selon son orientation, cette méthode permettant d'accroitre la visibilité des cellules. Il faudra donc déterminer les bonnes conditions lumineuses pour étudier le déplacement individuel des algues. Remarquons par ailleurs que le problème, s’il est moins conséquent que pour les algues individuelles, se pose de la même manière dans le cas de l’étude des phénomènes de groupes. L'usage d'une table optique, minimisant les tremblements, est envisagé.

Manipulation biologique
Bien que nous ne nous intéressions qu'aux propriétés physiques de ces agents actifs, il ne faut pas négliger le caractère vivant de nos sujets d'expériences. Ce faisant, il faudra s'attacher à une certaine stérilité du milieu expérimental et des conditions de stockage des algues (température et luminosité).

Récapitulatif des expériences:
En définitive, voici un résumé indicatif des expériences que nous allons réaliser afin d'apprécier au mieux la manière dont les micros-algues occupent l'espace qui est mis à leur disposition.

-Obtention du MSD pour des algues indépendantes. On traquera au cours du temps la position d'un certain nombre d'algues isolées pour obtenir le MSD, dont le profil temporel devrait être linéaire. On obtient {$\tau_{R}$} et donc {$D_{R}$}.
-Mesures de la vitesse individuelle des algues. Observation d'algues isolées avec et sans lumière (conformément à ce qui a été dit précédemment, il faudra trouver par tâtonnement des conditions lumineuses idéales) pour mesurer de la manière la plus fidèle possible la vitesse de déplacement des algues. On les soumettra notamment à la lumière pour voir si elles sont capables d'accélérer.
-Variation de la géométrie des canaux. Quantifier l'impact de la géométrie des canaux (PET -Mylar®) sur le comportement individuel et collectif des algues.
-Utilisation de la phototaxie pour rassembler les algues. Fuyant la lumière, nous rassemblerons les algues en les exposant à une source lumineuse intense.
-Force mécanique des algues. On confronte les algues à des micros-particules pour tester leur comportement quand elles sont directement confrontées à un obstacle solide. A priori, elles ne font que le « frôler » avec leurs flagelles et ne repoussent pas réellement l’obstacle (d’après l’article « Active particles in complex and crowded environments », paragraphe « Hydodynamics coupling to walls » de 2016). Selon cet article, l’effet d’un « mur solide » sur le déplacement des algues est le même que celui qu'aurait une autre algue située de l'autre côté de ce "mur solide". En utilisant la phototaxie, nous contraindrons les algues à pousser divers "murs solides", nous essayerons d'avoir un ordre de grandeur de la force mécanique des C.R..
-Phénomènes de groupe. Après les avoir rassemblées, nous laisserons les algues se diffuser, sous divers contraintes: exposition à des lumières plus ou moins intenses, changement de la viscosité du milieu de culture... Nous devrions observer une diffusion des algues selon la loi de Fick et ainsi, obtenir une nouvelle valeur de {$D_{T}$}.


Schéma du montage prévu pour observer la phototaxie

VI. Conclusion:

Sensibles à la lumière, les Chlamydomonas reinhardtii peuvent être manipulées. L'usage des outils susmentionnés permettra l'étude de leur mobilité et d’entrevoir leur dynamique de groupe. Les C.R. constituent un objet d'étude de premier plan dans des domaines variés tels que la cancérologie, la fabrication de biocarburant, ou l'écologie.


Figure 7: Premier aperçu des Chlamydomonas reinhardtii que nous utilisons

(microscopie optique grossissement x40 le 07/02/2020)

VII. Partie expérimentale

Ci-joint se trouve notre cahier de laboratoire, non rédigé il contient les informations techniques notées au fur et à mesure pendant nos manipulations.

VII.1- Premier problème: tracking des algues

Dans un premier temps, nous nous sommes consacrés au "tracking" des algues, permettant l'obtention du profil de leur MSD. Nous avons d'une part écrit un programme informatique permettant de tracer la position des algues individuellement au cours du temps et d'autre part, acquis un certain nombre de vidéos de ces dernières. Ces deux axes de travail principaux présentent un certain nombre de problématiques qu'il nous faut résoudre : le programme informatique doit être capable de différencier les algues (qui ne se meuvent pas simplement dans le plan et sont, parfois, agglomérées), les vidéos doivent comporter un nombre suffisant d'images qui doivent être facilement traitables.

a- Code

Après avoir effectué un premier tracking des algues à l'aide du module Trackmate d'ImageJ, ce dernier ne nous a pas semblé suffisamment performant. Le tracking recueilli est trop grossier et rigide. Nous avons ainsi décidé de développer nous-mêmes un script Python exploitant la bibliothèque Trackpy, créée pour "tracker" des particules et analyser des trajectoires à partir de vidéos préalablement converties en séquence d'images. Le code requiert un certain nombre de variables:

  • diameter : diamètre estimée du blob (en pixel)
  • mass : luminosité totale d'un blob
  • separation: distance de séparation entre deux blob détectés
  • maxsize : taille maximale d'un blob

Figure ici les principales commandes exploitées lors tracking.


Figure 8: a. (gauche) Image brute, b. (droite) Détection des microalgues

Les particules correctement détectées sur l'ensemble des images de la vidéo, le programme connecte les positions des particules au cours du temps (c'est-à-dire image par image). L'algorithme cherche autour de la position précédente d'une algue un autre blob ayant des caractéristique de mass et d'excentricité proches, paramètres suffisants pour différencier deux algues qui se sont percutées. Pour limiter la zone de recherche on estime une distance maximale de déplacement pour un pas de temps donné, avec une vitesse typique {$80~\mu m.s^{-1}$} et une fréquence d'acquisition de {$70~Hz$} la distance maximale fut choisi comme {$1.5~\mu m$} (soit une vitesse équivalente maximale de {$105~\mu m.s^{-1}$}). La détermination des trajectoires étant imparfaite, nous filtrons les blobs n'ayant pas été liés sur un nombre suffisamment grand d'images. On trace alors la trajectoire des blobs et nous calculons le déplacement quadratique moyen sur l'ensemble des particules.

b- Expériences

Conformément à l'étude théorique ci-dessus nous débutons l'analyse du mouvement des C.R. par tracker leur trajectoire et calculer leur déplacement quadratique moyen (MSD). Afin d'enrichir notre étude nous avons considéré 4 concentrations d'algues différentes, concentrations pour lesquelles nous avons effectué le protocole suivant. Grâce à une caméra (IDS modèle UI-3040CP-M-GL R2) fixée sur un microscope, nous filmons les algues à un grossissement permettant d'apprécier leur mouvement général pendant une trentaine de secondes pour chaque vidéo.
Etant donné la méthode de calcul du MSD, par le code susmentionné, la durée exploitable du MSD est dix fois plus courte que la durée d'acquisition. En effet l'origine temporelle et spatiale étant arbitraire, le MSD est calculé en glissant cette origine, i.e. chaque frame sera successivement considérée comme origine des temps. Le temps caractéristique du mouvement étant de l'ordre de 1 seconde nous décidons de capturer le mouvement pendant une trentaine de seconde, obtenant ainsi un MSD exploitable sur {$\approx 3s$}. Ainsi nous observons les différents régimes de déplacement des algues. Acquises et traitées (contraste) les vidéos sont segmentées en frames afin de lancer le tracking.
Avant de traiter les résultats que nous avons obtenus, présentons les conditions sous lesquelles nous avons réalisé nos expériences et les problématiques auxquelles il a fallu nous confronter. Il est très important de veiller à la répétabilité des expériences que nous réalisons pour que les quatre profils différents de MSD soient analysables et comparables.

  • Conditions expérimentales

Dans un premier temps, nous avons observé des algues CC-124 récupérées à l' IBPC-UMR 7141 CNRS (Institut de biologie physico-chimique), a priori plus motiles que les T222 (cf. section II). Cette espèce de C.R. fuit la lumière, ce qui ne nous importe pas pour cette partie de notre travail mais qui nous aurait handicapé dans la seconde, lorsque nous étudions la réaction des algues à la lumière. Toutefois, pour des raisons pratiques et pour utiliser les mêmes algues tout au long de notre projet, nous avons finalement préféré utiliser des algues CC-124 cultivées en incubateur au laboratoire MSC (au bâtiment Condorcet de l'Université Paris 7), approvisionné par le Chlamycenter (USA), qui elles, sont attirées par la lumière. Ces algues sont renouvelées d’une semaine à l’autre et on s’attache à réaliser toutes les expériences (dont les résultats seront comparés) à des intervalles de temps assez courts, le même jour. De plus, entre deux expériences différentes, l’échantillon d’algues utilisé est renouvelé, puisque l’échantillon sèche relativement vite et que les algues cessent donc de bouger (on suppose qu’elles meurent et/ou entrent dans une autre phase de leur vie). On considère ainsi que les algues utilisées d’une expérience à l’autre sont identiques, ou du moins qu’elles sont de même motilité.
Les algues sont plongées dans le noir (ou à la lumière rouge, ce qui est équivalent puisqu’elles y sont insensibles) quelques dizaines de minutes avant une expérience pour ne pas induire de comportement du à la lumière qui pourrait fausser les observations. De même, on place systématiquement un filtre rouge devant la lumière du microscope pour ne pas perturber leur mouvement lorsqu'elles sont filmées, la figure 9 expose le montage adopté lors de nos observations.


Figure 9: Schéma légendé de la microscopie utilisé pour les observations des microalgues


La plupart du temps, nous ne réutilisons pas les mêmes algues d’une semaine à l’autre. Dans les rares cas où nous avons été contraint logistiquement à réutilisée un même échantillon d'une semaine à l'autre nous avons respecter des conditions de stérilité, afin d’éviter toute prolifération de bactéries entre deux séances. Pour cela la manipulation des fioles contenants les algues c'est effectués au dessus d’un chalumeau. Ces conditions de stérilité ne sont en revanche pas importantes lorsque l’on manipule les algues pour les observer sur une échelle de temps de l’ordre de quelques minutes.
Quelques minutes avant le prélèvement d’un échantillon, on place la fiole contenant les algues sur une source de lumière blanche intense. Les algues les plus motiles, attirées par la lumière, se retrouvent au fond de la fiole; les algues qui sont mortes ou qui sont peu motiles flottent à la surface. Ainsi il nous suffit de prélever un échantillon de quelques millilitres au fond de la fiole afin d'extraite les algues les plus motiles.

  • Dilution des algues

Puisque nous cherchons à comparer le MSD des algues pour quatre différentes concentrations données, il nous faut trouver un moyen de quantifier la concentration en algues dans un échantillon donné. Exploitant les travaux effectués au sein du laboratoire MSC de l'Université Paris 7, la spectroscopie UV-Visible détermina la concentration des algues dans nos échantillons. Sous des hypothèses de dilution importante et de taille négligeable des algues, une densité optique de 1 à 580 nm correspond à une concentration de 3 millions d’algues/ml dans le milieu de culture (HSA) (à 10% prés). La longueur d'onde de 580nm est choisi afin de ne pas détruire, ni altérer l'échantillon. Nous avons considéré 4 échantillons d'algues diluées de densité optique respectives :

  • C1 = 0.706 (soit approximativement 2.12 millions d’algues/ml)
  • C2 = 0.359 (soit approximativement 1.08 millions d’algues/ml)
  • C3 = 0.121 (soit approximativement 0.36 millions d’algues/ml)
  • C4 = 0.092 (soit approximativement 0.28 millions d’algues/ml)

Figure 10: Frames extraites des quatre vidéos différentes, les blobs détectés sont entourés en rouge.

En exploitant le code susmentionné nous avons dénombrer le nombre d'algue sur chacune de nos captures vidéos, mise en relation avec les mesures spectroscopiques nous obtenons la figure suivante :


Figure 11: Densité optique en fonction du nombre d'algues détectées accompagné d'un ajustement polynomial d'ordre 2

Les barres d'incertitudes présentes sur la figure 11 sont issus du nombre variables d'algues détectées au cours de la vidéo; certaines d'entre elles sortant en effet du champ focal ou, en se déplaçant en trois dimension change de luminosité et donc deviennent (in)détectable. En toute rigueur l'observation des algues s'étant effectuées à la surface du liquide nous pouvons questionner quand à la représentativité du point de la concentration de cette "épaisseur de liquide" de quelque dizaine de microns. Contrairement à une loi simple de type Beer-Lambert la dépendance n'est pas linéaire. Comme expliqué dans l'artice de Koch,A.L Turbidity measurements of bacterial cultures in some available commercial instruments (1970) la relation parabolique entre la densité optique et la concentration d'algues s'explique principalement par la diffusion du faisceau de lumière incident par les particles i.e. les algues (cf théorie de Twersky). La loi de Beer-Lambert quant à elle ne considère que l'extinction par absorption. Cette description prédit une absorbance nulle pour une concentration non-nulle, en effet à haute concentration il diffusion de la lumière causé par une algues pourra être "compensé" par une autre algues diffusant également, permettant à une fraction du faisceau d'atteindre le détecteur. Deplus, comme le souligne Koch, " L'hyperbole prédit une limite à haute densité de cellule. Ce qui est faux à la limite, en effet la lumière ne pénètre pas un nuage infiniment dense". Malgré cela en absence de cadre théorique considérant quantitativement la concentration dans le déplacement des Chlamydomonas reinhardtii, la correcte ordonnation des échantillons nous fut suffisante pour la présente étude.

La caméra configurée, les vidéos acquises, nous traitons ces dernières afin de faciliter la détection des algues, en modifiant le contraste, le gain, la luminosité et la balance des couleurs (sur ImageJ). Finalement, nous segmentons les vidéos en un images avant de lancer le dit programme.
Voici un exemple de vidéo capturé pour une concentration C2 (environ 1.08 millions d’algues/ml), éclairé en lumière rouge, avec un grossissement de{$\times 40$}, le champ optique du microscope à un tel grossissement est de {$1.596\times1.197 mm$}.


Vidéo capturée pour C2 (grossissement x40)

  • Détermination des paramètres nécessaires au programme de track :

Comme nous l'avons brièvement dit, le programme informatique que nous avons finalement mis au point pour "tracker" les algues a besoin de connaître, afin de les identifier, le diamètre typique de celles-ci. En renseignant au programme la valeur communément admise de {$10~\mu m$} nous avons pu les détecter. Par la suite nous avons mesuré les tailles effectives des algues, dressant ainsi l'histogramme suivant (sur les différents échantillons, soit une dizaine de milliers d'algues différentes) :


Figure 12: Histogramme normalisé des diamètres des C.R.

On observe sur la figure 12 une distribution gaussienne centrée en {$10.70 \mu m$} avec un écart-type de {$0.34\mu m$}. Nous avons dans la suite de l'analyse renseigné cette valeur centrale de {$10.70 \mu m$} au programme en temps que nouveau diamètre typique. L'estimation des paramètres mass, separation et maxsize restants fut effectué par tâtonnement en fonction de nos observations.

c-Résultats, analyses et discussions

  • Description du mouvement

Clé de voûte de l'analyse des trajectoires, le tracking des C.R. c'est avéré trés performant. Les paramètres "diameter", mass, separation et maxsize évalués, l'application du programme à chaque vidéo permis d'obtenir des résultats satisfaisants. Malgré un important nombre d'algues, le programme est apte à discriminer chaque algue le long de leur mouvement qu'importent les nombreuses collisions entre algues, comme l'illustre les figures suivantes:


Figure 13: à gauche les trajectoires des C.R., à droite une prise de vue de l'échantillon brut (C1)

Figure 14: trajectoires et prise de vue des C.R. pour l'échantillon dilué (C4)

L'aptitude du programme vu également vérifié en superposant les trajectoires calculées aux images capturées :


Figure 15: Trajectoires superposées aux images capturées (séparés de 3/70 s)

Les données sur les blobs et de trajectoires collectées, nous avons débuté l'analyse. Pour un faible nombre d'algues, on peut facilement regarder la trajectoire de chacune d'entre elles, permettant d'apprécier la durée pendant laquelle le programme parvient à suivre une algue.

Le mouvement des Chlamydomonas reinhardtii dans son milieu est possible grâce à ses deux flagelles, d'une taille moyenne de {$12\mu m$}, qui effectuent des mouvements de brasse. Les flagelles balaient le liquide pour avancer, une fois les flagelles rabattus contre la paroi elle se repositionne à leur position initiale, faisant reculer l'algue. En effet l'algue ne subit pas (peu) d'inertie, comme l'expose le nombre de Reynolds {$Re=\frac{\rho V L}{\eta}=\frac{10^3\times50\times10^{-6}\times10\times10^{-6}}{10^{-3}}=5\times10^{-4}\ll 1$}. Proche du corps et colinéaire à la direction le repositionement des flagelles subit moins la friction que le rabat, aboutissant à un déplacement globale de l'algue .


Figure 16: Schéma du mouvement de brasse des C.R. sources: Garcia Michaël

Ce mouvement, élémentaire, qualifié de zigzag est exposé sur la trajectoire suivante.


Figure 17: Graphe de la trajectoire d'une C.R. avec agrandissement d'un mouvement de zigzag, caractéristique de leur déplacement élémentaire


Les battements de flagelles font décrire à l'algue un mouvement hélicoïdale (3D donc la projection 2D est capté par caméra) dans une direction quasi-fixée, puis change "aléatoirement" de direction après quelques secondes. Ces réorientations aléatoires sont occasionnées par la désynchronisation momentanée des flagelles.

Dans l'optique d’accroître notre compréhension du mouvement des Chlamydomonas reinhardtii, nous avons introduit un angle de persistance. Cet angle de persistance est égal à la différence d'orientation d'une algue entre deux instants séparés de {$\tau$}. On note: {$\theta (\tau)=arccos(\vec{e}(t).\vec{e}(t+\tau))$}, avec {$\vec{e}(t)$} le vecteur unitaire de déplacement instantané d'une algue à l'instant {$t$} (lui même défini comme le rapport du vecteur vitesse instantané par sa norme).


Figure 18: Introduction de l'angle de persistance.


Ainsi pour une particule se déplaçant en ligne droite, l'angle de persistance est nul, la particule conservant sa direction. Pour une particule changeant aléatoirement de direction à chaque instant, la distribution de l'angle de persistance sera au contraire équiprobable sur {$ [-\pi,\pi] $}.
Figure ci-dessous la distribution de l'angle de persistance {$\theta(\tau)$} pour différentes valeurs de {$\tau$}, calculée grâce aux trajectoires détectées sur l'échantillon C2.


Figure 19: Graphe de la distribution angulaire de l'angle de persistance pour l'échantillon C2

Conformément à l'intuition pour de très courts {$\tau$}, i.e. entre deux instants proches, les algues conservent leurs directions, l'angle de persistance est nul. Lorsque l'on considère des {$\tau$} plus importants la distribution devient moins piquée en zéro et tend à être équiprobable ({$\frac{1}{2\pi}\approx0.16$}). Autrement formulé, les Chlamydomonas reinhardtii conservent, conformément à la théorie, leur direction sur des temps courts puis changent aléatoirement de direction.
Afin de mettre en évidence des régularités dans l'angle de persistance, considérons la fonction d'autocorrélation de direction {$C(\tau)$} définie comme : {$C(\tau)=\langle cos(\theta(\tau)) \rangle$}; où {$ \langle . \rangle $} est une moyenne temporelle (et éventuellement d'ensemble). Pour un mouvement balistique nous avons pour rappel {$\theta(\tau)=0~\forall~\tau$} soit {$C(\tau)=1~\forall~\tau$} , à l'inverse pour un mouvement purement aléatoirement {$C(\tau)=0~\forall~\tau$}, en effet les directions adoptées entre deux instants sont décorrélées. Les Chlamydomonas reinhardtii possèdent un déplacement intermédiaire entre ces deux cas extrêmes, elles adoptent une marche aléatoire hélicoïdale isotrope avec persistance de direction.
Les C.R. se déplacent en tournant autour d'un axe dont la direction moyenne est constante lors de la partie run du mouvement run and tumble. La durée de rotation hélicoïdale {$t_h\approx0.46s$} pour notre espèce d'algues, est compatible en ordre de grandeur avec la littérature. Le projeté du mouvement hélicoïdales 3D est observable sur la figure suivante, la couleur change tous les {$t_h$}. Sur la trajectoire suivante, nous distinguons trois directions moyennes de déplacement. Initialement l'algue se déplace vers la gauche pendant {$13-14~t_h$}, vers le bas pendant la même durée avant d'aller vers la droite. Si l'on regarde la fonction d'autocorrélation calculée sur cette trajectoire on remarque que {$C(\tau\approx13-14~t_h)=0$}. Autrement dit, la différence de direction de l'algue entre deux instant séparés de {$13-14t_h$} est en moyenne de {$\frac{\pi}{2}$}, conformément à la trajectoire.


Figure 20: a. (gauche) graphe de la trajectoire colorée par section de {$t_h$}, b. (droite) graphe de la fonction d’auto-corrélation en direction associée

La décroissance exponentielle de l'enveloppe de la fonction d’auto-corrélation observée sur la figure 20.b est justifiée dans l'article de Peruani et al, intrinsèque au mouvement isotrope avec persistance, tandis que les oscillations s'expliquent par le mouvement hélicoïdale. En effet, après avoir effectué une rotation autour de l'axe moyen la particule se déplace selon la même direction, justifiant des oscillations de période {$t_h$}, au cours de laquelle l'angle de persistance augmente jusqu’à la demi-période puis diminue pour devenir quasi-nul.

  • Mean Square Displacement:

Comme mentionné dans la partie théorie, l'analyse du déplacement quadratique moyen est riche en information, raison pour laquelle, les trajectoires obtenues, nous avons calculé le MSD pour chacune des 4 concentrations considérées.


Figure 21: Graphe du MSD en échelle log-log accompagné du fit théorique {$\star$}

Le comportement est identique pour chacune des concentrations, une évolution balistique (dépendance temporelle quadratique) suivi d'une évolution diffusive (dépendance temporelle linéaire).

Un ajustement linéaire des différents MSD avec l'expression théorique {$MSD(t)=[4D_T+2v^2\tau_R]t+2v^2\tau_{R}^2[e^{-\frac{\tau}{\tau_R}}-1]~(\star)$} (Howse et al 2007) nous permet de déterminer les valeurs de {$D_t,v,\tau_R$}.


Figure 22: Graphe du MSD à différentes concentrations (C1, C2, C3, C4).


concentration{$D_T$}{$v$}{$\tau_R$}{$D_E$}
C1{$ 141.5\pm 2.3~ \mu.m^2.s^{-1}$}{$78.63\pm 0.15~\mu m.s^{-1}$}{$ 1.984 \pm 0.024~s$}{$6274\pm82~\mu.m^2.s^{-1}$}
C2{$ 157.3\pm 2.5~\mu.m^2.s^{-1}$}{$79.06\pm 0.15~\mu m.s^{-1}$}{$ 2.797 \pm 0.050~s$}{$8898\pm160~\mu.m^2.s^{-1}$}
C3{$ 142.3\pm 2.0 ~\mu.m^2.s^{-1}$}{$95.89\pm 0.10~\mu m.s^{-1}$}{$ 3.308 \pm 0.038~s$}{$15349\pm180~\mu.m^2.s^{-1}$}
C4{$ 106.5\pm 1.8 ~\mu.m^2.s^{-1}$}{$79.05\pm 0.10~\mu m.s^{-1}$}{$ 11.78 \pm 0.56~s$}{$36904\pm1700~\mu.m^2.s^{-1}$}


Pour un temps {$t \gg \tau_R$} on déduit de {$(\star)$} que {$MSD(t)\approx [4D_T+2v^2\tau_R]\times t$}. Pour un mouvement brownien l'expression du MSD à temps long est {$MSD(t)=4D\times t$}, ainsi par identification nous définissons un coefficient de diffusion effective {$D_E$}, qui prend en compte la nature active de la diffusion, {$D_E=D_T+\frac{1}{2}v^2\tau_R$}. Tout en étant en accord avec notre expression théorique, ces résultats sont du même ordre de grandeur que ceux trouvés dans la littérature. On observe une forte dépendance du coefficient de diffusion en la concentration des algues; moins les algues sont concentrées plus il est important, ces dernières s'entrechoquent en effet beaucoup moins (en témoigne {$\tau_R$}, qui traduit la durée entre deux réorientations aléatoires).

VII.2-Second problème: diffusion active

Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux algues en les considérant en tant que population plutôt que particules individuelles.
Le but de cette seconde expérience est d'observer leur diffusion active, c'est à dire le profil de leur fonction de distribution (PDF : Particle Distribution Function). Pour ce faire, nous avons choisi d'exploiter leur capacité à être attirées par la lumière. Nous rassemblons les algues au maximum dans un espace donné en les attirant grâce à une source lumineuse blanche intense et lorsque nous éteignons la lumière, nous nous attendons à observer une distribution des algues telle que décrite dans le paragraphe "phénomène de groupe". Il nous faudra, comme pour le premier problème que nous nous sommes posés, traiter numériquement des images acquises sous les meilleurs conditions possibles, ce qui pose un certain nombre de problèmes.

a-Code

De la même manière que pour le premier problème et avec le même matériel, nous avons acquis plusieurs centaines d'images des algues. Cependant, après avoir concentré l'essentiel des algues au même endroit, il n'était pas possible de détecter les particules individuellement de manière fiable, que ce soit manuellement ou numériquement. Le choix du grossissement du microscope permet certes d'observer la décroissance du gradient de concentration mais ne permet pas la bonne discernabilité des algues. Le gradient de concentration fut donc déterminé par une gradient de niveau de gris des images capturées.
Vous trouverez à cette adresse les lignes de code brutes qui nous ont permis de traiter les images et d'obtenir le profil du PDF. Il est à noter qu'aux images sont retirée la dernière afin de se débarasser du background

b-Expérience


Un certain nombre de problématiques expérimentales se sont imposées lorsque nous avons voulu obtenir des images permettant de tracer la PDF des algues.

Le problème qui se pose principalement lorsque nous réalisons cette expérience est celui du rassemblement des algues et donc de leur sensibilité à la lumière. Pour ne pas perturber le mouvement des algues, nous avons veillé à éteindre toute source lumineuse (ou à les couvrir d'un filtre rouge) dans la pièce pour se placer dans le noir, imparfait. De plus, avant d'obtenir leur PDF, nous avons souhaité estimer la sensibilité des algues à la lumière blanche. Pour ce faire, nous avons réalisé un montage très simple. Au montage exposé à la figure 9 est ajouté une lampe incandescente alimentée par un générateur de tension, obtenant ainsi une source lumineuse d'intensité réglable et quantifiable. Nous avons utilisé cette source lumineuse tout au long de l'expérience dont nous présenterons les différents résultats plus bas, mais nous avons parfois utilisé d'autres sources lumineuses (flash de téléphones, laser...) pour les observer qualitativement, n'obtenant guère de résultats pertinents (le montage était trop précaire ou les algues ne réagissaient pas). Il semblerait notamment qu'au delà d'une certaine intensité lumineuse, les algues fuient la lumière au lieu d'être attirées par elle, phénomène que nous n'avons pas su expliquer mais qui constitue un axe de recherche intéressant.

Lorsque nous avons souhaité rassembler les algues pour observer leur diffusion active, le problème de la structure du milieu dans lequel elles évoluent est survenu. En effet, si comme depuis le début, nous nous étions contentés de placer une goutte de "solution d'algues" et de repousser toutes les algues contre son ménisque, la hauteur de solution ne serait pas constante. Il est important de se rappeler que les algues évoluent dans les trois dimensions donc si la hauteur de liquide n'est pas constante, les observations que nous pourrions réaliser sur leur diffusion active serait erronée. Nous avons donc trouvé la solution idéale pour pallier à ce problème : nous avons réalisé, grâce à une lame de verre et du MYLAR, un canal dans lequel les algues pourraient évoluer de manière suffisamment libre (les dimensions des algues soient infiniment négligeables devant celles du canal) pour qu'on considère que le canal n'influence pas leur mouvement. De cette manière la hauteur de liquide serait complètement contrôlée et nous pouvons obtenir un PFD satisfaisant pour les algues.

c-Résultats et analyses

Dans un premier temps, nous avons cherché à estimer la sensibilité des algues à la lumière. Nous avons utilisé la lampe à incandescence d'intensité lumineuse variable pour soumettre les algues à des lumières plus ou moins intenses. Nous avons réalisé une série de vidéos des algues attirées par la lumière. Après avoir plongé les algues dans le noir pendant quelques minutes, nous les avons éclairées par la lampe incandescente, en augmentant progressivement l'intensité lumineuse.
Vidéo capturé montrant les algues attirés par la lumière (source à droite) :

Grâce à ces observations, on peut vérifier la capacité des algues à réaliser la phototaxie : elles sont effectivement attirées par la lumière.

Après avoir aggloméré les algues sur le bord du canal grâce à la lampe incandescente on éteint toutes les sources de lumière (et on couvre celle du microscope grâce à un filtre rouge) pour filmer la diffusion des algues pendant 1-2 minute(s) et cela pour deux grossissement différent. Pour le grossissement le plus faible {$\times 4$} les algues n'étant distinguables, nous avons traité les images en niveaux de gris afin de déterminer la concentration d'algues [Première ligne]. Pour le second grossissement {$\times 10$} les algues, distinguable, fut détecté et dénombré, exploitant le code susmentionné, permettant de tracer une fois encore la fonction de distribution de particule [Seconde ligne].
[Nous avons choisi d'utiliser l'échantillon dilué C2 (dont la concentration déterminée grâce à la spectroscopie UV-visible est d'environ 1 million d’algues/ml)]:

Etant donné le protocole expérimentale nous avons une diffusion dans une seule direction. En première approche, nous avons considéré la distribution de particule comme gaussien, en effet la solution de l’équation de diffusion établie dans la section théorique, pour un Dirac de concentration initiale en {$x=0$}, est {$ C(x,t)=\frac{C_0}{\sqrt{4\pi Dt}}e^{-\frac{x^2}{4Dt}}~(\clubsuit) $}. Bruité, l’ajustement entre nos données expérimentales et l'expression {$(\clubsuit)$} n'est pas concluant, raison pour laquelle nous avons calculé la variance {$\langle x^2 \rangle $} vis à vis de la position initiale i.e. de la paroi située en {$x=0$}. La figure suivante illustre l'évolution temporelle de l'écart type (carré de la variance) obtenue expérimentalement:


Figure 23: Evolution temporelle de l'écart type. Variances expérimentales accompagnées d'un ajustement en {$\propto ~t^{0.5}$}

En considérant, en première approche, que la paroi ne perturbe que peu la diffusion -autrement dit, qu'en son absence nous aurions obtenu le même profil symétrique vis à vis de l'axe {$x=0$}- on calcule la variance théorique {$\langle x^2 \rangle=\int_{-\infty}^{+\infty} x^2C(x,t)~dx=2Dt$}. L'écart type traduisant à quel point le profil de {$C(x,t)$} "s'étale", il est naturel de définir un coefficient de diffusion {$\mathcal{D}_E$} tel que {$\sigma=\sqrt{\mathcal{D}_E t}$}. Par identification nous obtenons le coefficient de diffusion effectif: {$\mathcal{D}_E=2D$}.
L'ajustement de nos données expérimentales avec l'expression précédente nous fournit la valeur numérique: {$\mathcal{D}_E=8869\pm295~\mu m^2.s{-1}$}.
Vérifions la compatibilité des valeurs du coefficient de diffusion mesuré par le PDF et le MSD : {$$Z=\frac{\mid D_{E-PDF}-D_{E-MSD} \mid}{\sqrt{\Delta_{PDF}^2+\Delta_{MSD}^2}}=0.01<1.96$$}. Ainsi nous ne pouvons pas rejeter l’hypothèse de compatibilité des deux mesures au seuil de 5%.

Le dénombrement précise des particules avec le second grossissement permis de vérifier le comportement gaussien du PDF. En effet la concentration d'algue au niveau de la paroi, {$x=x_0$}, décroit comme {$\propto t^{-0.5}$}, comme l'indique la figure 24 ci-dessous.


Figure 24: Concentration en algues en {$x=x_0$} au cours du temps

De {$(\clubsuit)$} nous déduisons que {$ C(x_0,t)=\frac{C_0}{\sqrt{4\pi Dt}}~\propto t^{-0.5}$}; aux données expérimentales est adjointe un ajustement avec une loi {$\propto t^{-0.5} $}. Ainsi les résultats expérimentaux sont, une fois encore, compatibles avec une distribution normale, le précédent calcul du coefficient de diffusion semble ainsi pertinent.

VII.3-Problématiques diverses

D'autres axes de réflexion se sont ouverts à nous, mais nous n'avons pas pu les exploiter à cause des limites de notre montage expérimental.

  • Force mécanique des algues

Comme nous l'avons mentionné, nous prévoyions d'étudier la force mécanique des algues. En confrontant les algues à des micro-particules (des "murs solides") nous aurions essayé d'estimer un ordre de grandeur de la force mécanique des C.R. Cependant, nous nous sommes immédiatement rendus compte qu'avec le microscope et la caméra que nous avions à notre disposition, il aurait été impossible d'observer tout choc entre les algues et un obstacle solide. Les micro-particules sont trop grosses par rapport aux micro-algues, ces dernières, même en grand nombre, ne percutent que trop rarement l'obstacle et de toutes manières, elles le font de manière trop faible pour que l'obstacle bouge, rendant toute estimation de force impossible. La modification de la viscosité aurait pu être un moyen d'estimer cette force. Comme mis en place et expliqué dans la thése de M.Garcia, l'ajout de molécule de dextran ayant une masse mololaire très élevé 3.000 u à 2.000.000 u permet de modifier la viscosité du fluide tout en assurant une compabilité biologique. En mesurant la vitesse des algues pour différentes viscosité de fluide nous pourrions determiné la force mécanique déployé par les Chlamydomonas Reinhardtii avec d'avantage de précision. En effet jusqu'alors nous avons qu'une seule valeur de viscosité. En considérant les C.R. comme des sphères de rayon R se déplacant dans un milieu de viscosité {$\eta$} à une vitesse v la force de friction du milieu est {$F=6\pi\eta R v=6\pi\times10^{-3}\times80\times10^{-6}\times10\times10^{-6}=15pN$} déduit de la loi de Stokes.

  • Flagelles

À l'instar des auteurs de l'article Chlamydomonas Swims with Two "Gears" in a Eukaryotic Version of Run-and-Tumble Locomotion nous avions le projet d'étudier la manière de se mouvoir des algues prises isolément, c'est-à-dire grâce à un battement asynchrone de leurs flagelles. Cependant, malgré le degré de sophistication de notre matériel et un objectif de grossissement maximal, nous n'avons jamais pu observer les algues de manière si rapprochée. La finesse des flagelles, épais de quelque microns, rentre en conflit avec la limite de l'observation optique causée par la diffraction. Au delà de toute observation des flagelles des algues, toute étude de leur mouvement était de ce fait rendue impossible. Nous nous sommes donc contentés d'observer le mouvement de "run and tumble" des algues et leur comportement de groupe.

VIII. Conclusion

Les Chlamydomonas reinhardtii se confirment ici comme système modèle permettant un grand nombre d'études sur différentes questions de physique et de biologie. Riche en informations, le tracking de celles-ci a favorisé notre appréciation à la fois de leur mouvement et de leur dynamique de groupe. Nos nombreuses acquisitions ainsi que les calculs du déplacement quadratique moyen (MSD) nous confirment d'une part le mouvement de "run and tumble" des micro-algues, comme établi dans la littérature, et d'autre part la présence de deux régimes lors de celui-ci: un premier balistique et un second diffusif. La détermination du MSD pour des échantillons nous permet, de plus, d'observer la diffusion des particules en fonction de la concentration en algues. Introduire l'angle de persistance fut particulièrement pertinent, complétant ainsi notre étude de leur mouvement individuel. Le calcul de la distribution de particules nous informe, tout comme le MSD, de la diffusion active des micro-algues, tout en constituant une mesure de leur photosensibilité, caractéristique phare de ces organismes unicellulaires. Nos résultats, comparables à la littérature scientifique, sont également en parfait accord avec nos données de tracking, démontrant l'optimisation de ce dernier, élément clef de ce projet.
Il aurait été intéressant, à titre d'exploration, de retrouver ces résultats en exploitant le caractère chimiotactique des micro-algues et d'ainsi prendre connaissance des substances auxquelles elles étaient le plus sensible. Bien que ce projet nous a permis de réaliser une étude satisfaisante du mouvement des micro-algues à l'échelle observée, un microscope avec des objectifs à plus gros grossissement aurait également permis d'observer les flagelles, et donc de pouvoir étudier de plus près leur mécanisme élémentaire de nage.
Ce projet fut l'occasion pour nous de découvrir un champ de recherche avec lequel nous étions jusqu'alors peu familiers, et de renforcer nos connaissances en physique, ainsi que de nous accoutumer aux protocoles biologiques.

IX. Remerciements:

Nous tenons à remercier Dražen Zanchi, pour nous avoir guidé tout au long de ce projet et nous avoir fait découvrir la richesse des micro-algues, à Sandrine Bujaldon (IBPC) et Aïna Ramamonjy (MSC) pour nous avoir fourni en Chlamydomonas reinhardtii, mais également à Julien Dervaux (MSC) pour nous avoir aidé à déterminer la concentration en algues de nos différents échantillons lorsque cela fut nécessaire. Un grand merci à toute l'équipe enseignante et technique qui nous encadré dans cette UE, qui a montré de l'intérêt pour notre projet et nous ont épaulé au cours de celui-ci.

X. Sources:

-Self-Motile Colloidal Particles: From Directed Propulsion to Random Walk - Howse et al - Phys. Rev. Lett - 10.1103/PhysRevLett.99.048102
-Point of View: Are theoretical results ‘Results’? - Goldstein R.E - eLife - 10.7554/eLife.40018
-Chlamydomonas Swims with Two "Gears" in a Eukaryotic Version of Run-and-Tumble Locomotion - Paulin et al - Science (New York, N.Y.) - 10.1126/science.1172667
-Description du phénomène de "run and tumble": Andrea Schmidt MIT (consulté en février 2020)
-Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. - Ken-ichi Wakabayashi and Stephen M. King - The Journal of Cell Biology - 10.1083/jcb.200603019
-Quantitative analysis of the chemotaxis of a green alga, Chlamydomonas reinhardtii, to bicarbonate using diffusion-based microfluidic device - Choi Hi - Biomicrofluidics - 10.1063/1.4942756
-Chemotaxis towards sugars in Chlamydomonas reinhardtii - Ermilova, Elena V. - Current Microbiology-10.1007/BF01576833
-Active Particles in Complex and Crowded Environments - Bechinger, Clemens et al - Review of Modern Physics -Review of Modern Physics
-Hydrodynamics of microswimmers - Garcia Michaël - Theses - tel-00952771
-Chlamydomonas Resource Center (consulté en mars 2020)
-Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies - Crocker J.C, Grier D.G - Journal of Colloid and Interface Science - 10.1006/jcis.1996.0217
-The Natural History of Model Organisms: From molecular manipulation of domesticated Chlamydomonas reinhardtii to survival in nature - Sasso et al - eLife - 10.7554/elife.39233
- Self-Propelled Particles with Fluctuating Speed and Direction of Motion in Two Dimensions - F. Peruani and L. Morelli. - Physical Review Letters 2007 - 10.1103/PhysRevLett.99.010602
- Mesures de biomasse et mesures de densité optique DO (opacimétrie) avec un spectrophotomètre visible ou UV-visible classique - J.F. Perrin - (consulté le 12/05/2020)
- UV-visible Spectroscopy - Pavan M. V. Raja & Andrew R. Barron - Chemlibretexts (consulté le 12/05/2020)
-General calibration of microbial growth in microplate readers - Stevenson, K., McVey, A., Clark, I. et al - Sci Rep - 10.1038/srep38828
-Turbidity measurements of bacterial cultures in some available commercial instruments - Arthur L. Koch - Analytical Biochemistry - 10.1016/0003-2697(70)90174-0

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