MESURES PAR PIV explications et kit.

Dans cette page, je vous explique comment est faite l'analyse des champs de vitesse dans les tissus embryonnaires.

Tout d'abord, il faut partir d'un film de développement, comme le film ci-joint. Il est évidemment très important d'avoir un bon film. Travailler sur de mauvaises données donne de mauvais résultats. Pour obtenir de bons résultats, il faut que les images possèdent un "grain" caractéristique (ici le grain cellulaire), qui puisse être suivi optiquement. Par ailleurs, il faut que l'image vue change peu entre deux temps consécutifs. par conséquent, il faut acquérir les images sur une base de temps assez fine. (Ici 30 secondes d'intervalle entre plans). Le film ci-joint représente 145 minutes de développement d'un embryon de poulet au stade "début de récession du noeud de Hensen" (pour les spécialistes; en fait c'est juste que le tissu se rentre lui-même par la fente qu'on voit à droite et en rentrant tire sur lui-même sur la couche supérieure).
En premier lieu, téléchargez ImageJ. Par exemple sur le site de Wayne Rasband Download ImageJ
Pour traiter ce film nous allons utiliser le module TRACKER développé par Olivier Cardoso, et modifié au cas par cas par quelques personnes dont moi-même et Bérangère Abou. Glissez simplement le dossier TRACKER dans le dossier PLUGINS installé avec ImageJ.
Download TRACKER MODULE
Tout d'abord, il est fréquent que les échantillons dérivent sous le microscope. Soit que la dilatation thermique du microscope suffise à déplacer l'image, soit qu'il y ait de petits effets thermo capillaires (Marangoni) à l'intérieur de la boîte de Petri. On va donc supprimer cette dérive en utilisant le Plugin StackReg. Aller dans l'onglet Plugins dérouler StackReg, exécuter StackReg, sélectionner translation, et exécuter le Plugin. Attention, ça peut être très long (de quelques secondes à un quart d'heure suivant la taille du film).
On obtient alors le film ci-joint, dans lequel la dérive (ici verticale et vers le bas) a été supprimée numériquement. Notez que la mise en registre des plans, a créé une zone d'image blanche correspondant à la zone de glissement de l'embryon. Cependant, l'embryon est maintenant bien centré, fixe dans le repère absolu.
Ce film est si long que les mouvements sont de très grande ampleur. Afin d'extraire l'équivalent d'un champ de vitesse instantanée, on va réduire l'intervalle de temps étudié. On peut choisir des intervalles de 10 minutes, ou même, des intervalles de 30 secondes. Pour cela, on prendra deux plans consécutifs. On crée donc un STACK d'images (c'est-à-dire un film dans ImageJ, comportant seulement deux images) de deux images consécutifs de la façon suivante : créer deux images blanches (avec New), faire couper coller de deux plans consécutifs. Fermer le long film, et assembler les deux images avec IMAGES TO STACKS, dans l'onglet windows, qui crée un film de deux images.
Ensuite on définit les points pour le calcul de la vitesse. Pour cela deux techniques : ou bien la définition à la main de chaque point de calcul. Ou bien une méthode automatique.

Pour définir à la main les points, utiliser l'outil de sélection "point" présent dans la barre de menu de ImageJ. Cliquer sur la petite croix dans la barre de menu. Puis glisser la souris dans l'image. A chaque clic suivi de Ctrl-M, on engrange un point dans le tableau. On obtient alors un tableau de points, définis par leur rang, leurs coordonnées, et la valeur du niveau du pixel (attention: assurez-vous que les points sont définis en unités de pixels -le paramétrage de l'unité des coordonnées se trouve dans l'onglet Analyze, sous-onglet set-scale).

On lance ensuite le module tracker en executant le plugin trackcentri. Aller dans Plugin, dérouler l'onglet, c'est vers le bas.
Et l'on obtient le vecteur local, ou bien la ligne d'émission du point. Pour obtenir le vecteur local utiliser DRAWCENTRIBATON. Pour obtenir les lignes d'émission, utiliser DRAWCENTRI. Si vous voulez changer les couleurs, ou la forme des tracés il faut aller dans le plugin avec un outil d'édition (genre bloc-notes) et modifier les paramètres du type (0,color,0). On ne peut pas le faire à l'écran.
Pour définir automatiquement les points on utilise l'outil de sélection GRIDSELECTION, qui construit automatiquement un fichier de points couvrant la sélection (Region of Interest), avec un intervalle choisi (pour choisir l'intervalle, modifier la variable "intervalle" et recompiler la macro. A la souris, on sélectionne un rectangle, le fichier de points, avec la bonne structure de caractères invisibles (tabulateurs, retours charriots) est généré automatiquement. Cette macro est disponible en java pour ImageJ, ici :

Download Macro de selection automatique de grilles

Cette macro très pratique est aussi disponible sous NIHImage,me contacter

On importe alors le fichier de points en allant dans Import > Results.
On lance ensuite le module tracker et l'on obtient le champ de vecteur local.
La citation de la page : "Ceux qui ne veulent imiter personne, ne créent jamais rien", Salvador Dali.
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